NOVAS VARIEDADES DE TRIGO E DOENÇAS.
HÁ UMA LIGAÇÃO?
Old and modern wheat (Triticum aestivum L.) cultivars and their potential to elicit celiac disease
Darina Pronin, Andreas Börner e Katharina Anne Scherf
I
One potential explanation for the increasing prevalence of celiac disease (CD) over the past decades is that breeding may have inadvertently changed the immunoreactive potential of wheat. To test this hypothesis, we quantitated four CD-active peptides, namely the 33-mer and peptides containing the DQ2.5-glia-α1a/DQ2.5-glia-α2 (P1), DQ2.5-glia-α3 (P2) and DQ2.5-glia-γ1 (P3) epitopes, in a set of 60 German hexaploid winter wheat cultivars from 1891 to 2010 and grown in three consecutive years. The contents of CD-active peptides were affected more by the harvest year than by the cultivar. The 33-mer and P1 peptides showed no tendency regarding their absolute contents in the flour, but they tended to increase slightly over time when calculated relative to the α-gliadins. No trends in relative or absolute values were observed for the P2 and P3 peptides derived from α- and γ-gliadins. Therefore, the immunoreactive potential of old and modern wheat cultivars appears to be similar.
Uma explicação potencial para o aumento da prevalência da doença celíaca (DC) nas últimas décadas é que o melhoramento genético pode ter alterado inadvertidamente o potencial imunorreativo do trigo. Para testar esta hipótese, quantificamos quatro peptídeos ativos em CD, nomeadamente o 33-mer e peptídeos contendo DQ2.5-glia-α1a/DQ2.5-glia-α2 (P1), DQ2.5-glia-α3 (P2) e epítopos DQ2.5-glia-γ1 (P3), em um conjunto de 60 cultivares hexaplóides alemãs de trigo de inverno de 1891 a 2010 e cultivadas em três anos consecutivos. Os teores de peptídeos ativos em CD foram afetados mais pelo ano de colheita do que pela cultivar. Os peptídeos 33-mer e P1 não apresentaram tendência em relação ao seu conteúdo absoluto na farinha, mas tenderam a aumentar ligeiramente ao longo do tempo quando calculados em relação às α-gliadinas. Não foram observadas tendências em valores relativos ou absolutos para os peptídeos P2 e P3 derivados de α e γ-gliadinas. Portanto, o potencial imunorreativo das cultivares de trigo antigas e modernas parece ser semelhante.
Introduction
Wheat is a staple food of mankind, but its consumption is also linked to wheat-related disorders, such as celiac disease (CD), wheat allergy or non-celiac gluten sensitivity. CD affects about 1% of the population worldwide and is characterized by chronic inflammation of the small intestine, which results in destruction of the epithelial cells and consequently in nutrient malabsorption (Caio et al., 2019). In genetically predisposed individuals, CD can be initiated by ingestion of the storage proteins of wheat (gliadins, glutenins), barley (hordeins) and rye (secalins) (Abadie, Sollid, Barreiro & Jabri, 2011). Wheat storage proteins comprise gliadins and glutenins and are usually classified into gliadin types (ω5-, ω1,2-, α-, and γ-gliadins) and high- (HMW-GS) and low-molecular-weight glutenin subunits (LMW-GS) (Scherf, Koehler & Wieser, 2016). As their name suggests, prolamins are rich in the amino acids proline and glutamine (Arentz-Hansen et al., 2002, Shan et al., 2005). The disability of human gastrointestinal enzymes to cleave proteins before or after proline and glutamine results in the persistence of large CD-active peptides with nine or more amino acid residues, which are absorbed into the lamina propria and initiate the inflammatory reaction in CD patients (Plugis & Khosla, 2015).
All gluten proteins contain CD-active epitopes with distinct levels of stimulatory potential (Tye-Din et al., 2010), but gliadin peptides are usually considered to be most toxic, inter alia, because the incomplete digestion of gliadins results in a 33-mer peptide (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF) (Qiao et al., 2004). The 33-mer is derived from α2-gliadin of hexaploid wheats, but not present in tetraploid emmer and durum wheat and diploid einkorn, because the D-genome, which encodes α2-gliadin, is absent (Ozuna, Lehisa, Gimenez, Alvarez, Sousa & Barro, 2015). The 33-mer is considered to be the most immunodominant peptide (Qiao et al., 2005, Shan et al., 2005), because it contains six partly overlapping epitopes, in particular PFPQPQLPY (DQ2.5-glia-α1a, one repetitive unit), PYPQPQLPY (DQ2.5-glia-α1b, two repetitive units) and PQPQLPYPQ (DQ2.5-glia-α2, three repetitive units) (Arentz-Hansen et al., 2000, Sollid et al., 2020). Two monoclonal antibodies (mAbs, A1 and G12) have been developed against the 33-mer for use in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for gluten detection (Morón et al., 2008, Morón et al., 2008). The two most commonly used sandwich ELISA test kits are based on the R5 (Valdés, García, Llorente & Méndez, 2003) and G12 mAbs (Morón et al., 2008, Morón et al., 2008).
One hypothesis to explain the rising prevalence of CD in the population (Gatti et al., 2020, Singh et al., 2018) is that wheat breeding may have contributed to increasing the immunostimulatory potential of modern wheats (cultivars developed after 1950) compared to old wheats and landraces (van den Broeck et al., 2010).
Several studies have already set out to verify or falsify this hypothesis, but with partly contradictory results. A recently developed method based on a stable isotope dilution assay (SIDA) paired with liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was used to quantitate the 33-mer in 15 old and 23 modern common wheat cultivars, but no trends towards increased contents of the 33-mer in modern cultivars were identified (Schalk et al., 2017, Schalk et al., 2018).
Malalgoda, Meinhardt & Simsek (2018) used SIDA LC-MS/MS to quantitate two CD-active epitopes, namely DQ2.5-glia-α1 (PFPQPQLPY) and DQ2.5-glia-α3 (FRPQQPYPQ), present in α-gliadins of 30 different spring wheat cultivars from North Dakota of the past 100 years. This study suggested a random variation of the epitope contents over all cultivars and no relation to the cultivar release year. Boukid et al. (2017) determined the antigenicity of 100 Tunisian durum wheat cultivars of the 20th century and the results indicated a high variability in the contents of immunogenic peptides resulting from different environmental conditions, but again not related to the release year of the cultivars. A comparable study found that the DQ2.5-glia-α1a peptide was present in all durum wheat cultivars studied and that the amount was affected more by the cultivar than by the environmental conditions (Prandi, Mantovani, Galaverna & Sforza, 2014).
The same group determined ten immunogenic peptides in old and modern Italian common wheat cultivars and showed that the old cultivars had higher contents of immunogenic peptides than modern ones (Prandi, Tedeschi, Folloni, Galaverna & Sforza, 2017).
Ribeiro, Rodriguez-Quijano, Nunes, Carrillo, Branlard & Igrejas (2016) analyzed 53 modern wheat varieties and 19 old landraces using the R5 competitve ELISA and found that the reactivity did not increase over time, but that landraces even had higher reactivity.
Another study by Escarnot, Gofflot, Sinnaeve, Dubois, Bertin, & Mingeot (2018) used A1 and G12 mAbs to analyze 195 wheat accessions and determined no significant differences in reactivity of landraces, old, mid and modern wheat varieties.
In contrast, van den Broeck, Cordewener, Nessen, America & van der Meer (2015) performed a label-free determination of the immunogenic epitopes DQ2.5-glia-α1a, DQ2.5-glia-α2 and DQ2.5-glia-α3 in three wheat cultivars, demonstrating that one modern wheat cultivar contained a higher amount of the epitopes. In a previous study, van den Broeck et al. (2010) analyzed 36 modern European wheat cultivars and 50 landraces using ELISA. The results indicated that higher amounts of DQ2.5-glia-α1a were present in modern wheat cultivars than in landraces, with the exception of a few modern cultivars.
Taken together, the evidence whether old or modern wheat cultivars have higher or lower contents of CD-active peptides is inconclusive so far, because only small sample sets were studied or samples that were not grown under the same conditions to ensure comparable environmental conditions. Therefore, the aim of our study was to investigate the influence of breeding on the contents of four major CD-active peptides by LC-MS/MS in a very well-characterized sample set of 60 German hexaploid wheat cultivars from 1891 to 2010 grown in three consecutive harvest years. All cultivars and selected gliadin fractions and types were also investigated regarding their influence on the ELISA responses, using the R5 and G12 mAbs to get further insights into their immunoreactive potential.
introdução
O trigo é um alimento básico da humanidade, mas o seu consumo também está ligado a doenças relacionadas com o trigo, como a doença celíaca (DC), a alergia ao trigo ou a sensibilidade não celíaca ao glúten. A DC afeta cerca de 1% da população mundial e é caracterizada pela inflamação crônica do intestino delgado, que resulta na destruição das células epiteliais e consequentemente na má absorção de nutrientes (Caio et al., 2019). Em indivíduos geneticamente predispostos, a DC pode ser iniciada pela ingestão de proteínas de armazenamento do trigo (gliadinas, gluteninas), cevada (hordeínas) e centeio (secalinas) (Abadie, Sollid, Barreiro & Jabri, 2011). As proteínas de armazenamento do trigo compreendem gliadinas e gluteninas e são geralmente classificadas em tipos de gliadina (ω5-, ω1,2-, α- e γ-gliadinas) e subunidades de glúten de alto (HMW-GS) e baixo peso molecular (LMW- GS) (Scherf, Koehler & Wieser, 2016). Como o próprio nome sugere, as prolaminas são ricas nos aminoácidos prolina e glutamina (Arentz-Hansen et al., 2002, Shan et al., 2005). A incapacidade das enzimas gastrointestinais humanas de clivar proteínas antes ou depois da prolina e da glutamina resulta na persistência de grandes peptídeos ativos para CD com nove ou mais resíduos de aminoácidos, que são absorvidos pela lâmina própria e iniciam a reação inflamatória em pacientes com DC (Plugis & Khosla, 2015).
Todas as proteínas do glúten contêm epítopos ativos para CD com níveis distintos de potencial estimulador (Tye-Din et al., 2010), mas os peptídeos de gliadina são geralmente considerados os mais tóxicos, entre outras coisas, porque a digestão incompleta das gliadinas resulta em um 33-peptídeo mer (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF) (Qiao et al., 2004).
O 33-mer é derivado da α2-gliadina de trigos hexaplóides, mas não está presente no emmer tetraplóide e no trigo duro e no einkorn diplóide, porque o genoma D, que codifica a α2-gliadina, está ausente (Ozuna, Lehisa, Gimenez, Alvarez, Sousa e Barro, 2015). O 33-mer é considerado o peptídeo mais imunodominante (Qiao et al., 2005, Shan et al., 2005), porque contém seis epítopos parcialmente sobrepostos, em particular PFPQPQLPY (DQ2.5-glia-α1a, um repetitivo unidade), PYPQPQLPY (DQ2.5-glia-α1b, duas unidades repetitivas) e PQPQLPYPQ (DQ2.5-glia-α2, três unidades repetitivas) (Arentz-Hansen et al., 2000, Sollid et al., 2020). Dois anticorpos monoclonais (mAbs, A1 e G12) foram desenvolvidos contra o 33-mero para uso em ensaios imunoenzimáticos (ELISA) para detecção de glúten (Morón et al., 2008, Morón et al., 2008). Os dois kits de teste ELISA sanduíche mais comumente usados são baseados nos mAbs R5 (Valdés, García, Llorente & Méndez, 2003) e G12 (Morón et al., 2008, Morón et al., 2008).
Uma hipótese para explicar a crescente prevalência de DC na população (Gatti et al., 2020, Singh et al., 2018) é que o melhoramento genético do trigo pode ter contribuído para aumentar o potencial imunoestimulante dos trigos modernos (cultivares desenvolvidas após 1950) em comparação com trigos velhos e raças locais (van den Broeck et al., 2010).
Several studies have already set out to verify or falsify this hypothesis, but with partly contradictory results. A recently developed method based on a stable isotope dilution assay (SIDA) paired with liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was used to quantitate the 33-mer in 15 old and 23 modern common wheat cultivars, but no trends towards increased contents of the 33-mer in modern cultivars were identified (Schalk et al., 2017, Schalk et al., 2018).
Vários estudos já se propuseram a verificar ou falsificar esta hipótese, mas com resultados parcialmente contraditórios. Um método recentemente desenvolvido baseado em um ensaio de diluição de isótopos estáveis (SIDA) emparelhado com espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida (LC-MS/MS) foi usado para quantificar o conteúdo de 33-mer em 15 cultivares de trigo comum antigas e 23 modernas, mas nenhuma tendência para aumento de 33-mer foi identificada em cultivares modernas (Schalk et al., 2017, Schalk et al., 2018).
Malalgoda, Meinhardt & Simsek (2018) usaram SIDA LC-MS/MS para quantificar dois epítopos ativos para CD, nomeadamente DQ2.5-glia-α1 (PFPQPQLPY) e DQ2.5-glia-α3 (FRPQQPYPQ), presentes em α- gliadinas de 30 cultivares diferentes de trigo de primavera da Dakota do Norte nos últimos 100 anos. Este estudo sugeriu uma variação aleatória do conteúdo de epítopos em todas as cultivares e nenhuma relação com o ano de lançamento da cultivar. Boukid et al. (2017) determinaram a antigenicidade de 100 cultivares de trigo duro tunisiano do século XX e os resultados indicaram uma alta variabilidade no conteúdo de peptídeos imunogênicos resultante de diferentes condições ambientais, mas novamente não relacionada ao ano de lançamento das cultivares. Um estudo comparável descobriu que o peptídeo DQ2.5-glia-α1a estava presente em todas as cultivares de trigo duro estudadas e que a quantidade foi afetada mais pela cultivar do que pelas condições ambientais (Prandi, Mantovani, Galaverna & Sforza, 2014).
O mesmo grupo determinou dez peptídeos imunogênicos em cultivares italianas antigas e modernas de trigo mole e mostrou que as cultivares antigas apresentavam maiores teores de peptídeos imunogênicos do que as modernas (Prandi, Tedeschi, Folloni, Galaverna & Sforza, 2017).
Ribeiro, Rodriguez-Quijano, Nunes, Carrillo, Branlard & Igrejas (2016) analisaram 53 variedades modernas de trigo e 19 variedades locais antigas usando o ELISA competitivo R5 e descobriram que a reatividade não aumentou ao longo do tempo, mas que as variedades locais tiveram até maior reatividade.
Outro estudo realizado por Escarnot, Gofflot, Sinnaeve, Dubois, Bertin, & Mingeot (2018) utilizou mAbs A1 e G12 para analisar 195 acessos de trigo e não determinou diferenças significativas na reatividade de raças locais, variedades de trigo antigas, médias e modernas. Em contraste, van den Broeck, Cordewener, Nessen, America & van der Meer (2015) realizaram uma determinação sem rótulo dos epítopos imunogênicos DQ2.5-glia-α1a, DQ2.5-glia-α2 e DQ2.5-glia -α3 em três cultivares de trigo, demonstrando que uma cultivar de trigo moderna continha uma quantidade maior de epítopos. Em um estudo anterior, van den Broeck et al. (2010) analisaram 36 cultivares de trigo europeias modernas e 50 variedades locais usando ELISA. Os resultados indicaram que quantidades maiores de DQ2.5-glia-α1a estavam presentes nas cultivares modernas de trigo do que nas variedades locais, com exceção de algumas cultivares modernas.
Tomadas em conjunto, as evidências de que cultivares de trigo antigas ou modernas têm teores mais elevados ou mais baixos de péptidos activos em CD são inconclusivas até agora, porque apenas pequenos conjuntos de amostras foram estudados ou amostras que não foram cultivadas sob as mesmas condições para garantir condições ambientais comparáveis. Portanto, o objetivo do nosso estudo foi investigar a influência do melhoramento no conteúdo de quatro principais peptídeos ativos para CD por LC-MS/MS em um conjunto de amostras muito bem caracterizado de 60 cultivares de trigo hexaplóides alemães de 1891 a 2010 cultivadas em três anos de colheita consecutivos. Todos os cultivares e frações e tipos de gliadina selecionados também foram investigados quanto à sua influência nas respostas de ELISA, utilizando os mAbs R5 e G12 para obter mais informações sobre o seu potencial imunorreativo.
Fonte
II
Pesquisa analisou sementes para tentar entender mudanças que podem estar levando ao aumento no número de pessoas com intolerância ou sensibilidade ao glúten
Nos últimos anos, o número de pessoas afetadas por doença celíaca, alergia ao trigo ou sensibilidade ao glúten ou ao trigo aumentou drasticamente. Mas por que isso tem acontecido? Será que as variedades modernas de trigo contêm mais glutén, uma proteína imunorreativa, do que no passado? Os resultados de um estudo do Instituto Leibniz de Biologia de Sistemas Alimentares da Universidade Técnica de Munique e do Instituto Leibniz de Genética Vegetal e Pesquisa de Plantas Culturais ajudam a responder essa pergunta.
Os grãos de trigo contêm cerca de 70% de amido. Seu conteúdo de proteína é geralmente de 10 a 12%. O glúten é responsável pela maior parte dessas proteínas, em geral cerca de 75 a 80%. O glúten é uma mistura composta por diferentes moléculas de proteína e que podem ser divididas em dois subgrupos: ‘gliadinas’ e ‘gluteninas’.
Há muito se sabe que as proteínas do trigo podem desencadear doenças como a doença celíaca ou alergias ao trigo. Aproximadamente um o meio por cento da população adulta é afetada em todo o mundo. Além disso, a sensibilidade não celíaca ao glúten está cada vez mais comum no mundo ocidental.
“Muitas pessoas temem que as variedades modernas de trigo contenham mais proteínas imunorreativas do que no passado e que esta seja a causa do aumento da incidência de doenças relacionadas ao trigo”, comenta Darina Pronin, do Leibniz-Institute for Food Systems Biology, que esteve significativamente envolvida no estudo como parte de sua tese de doutorado. No que diz respeito ao glúten, o grupo de proteínas das gliadinas em particular é suspeito de causar reações imunológicas indesejadas, explica a pesquisadora.
60 variedades de trigo analisadas
Mas quão grandes são as diferenças entre as variedades de trigo novas e antigas? Para ajudar a esclarecer isso, Katharina Scherf e sua equipe do Leibniz-Institute for Food Systems Biology investigaram o teor de proteína de 60 das variedades de trigo mais comuns no período entre 1891 e 2010. Isso foi possível porque o Instituto Leibniz possui um extenso arquivo de sementes. Do arquivo, os pesquisadores selecionaram cinco variedades de trigo principais para cada década dos 120 anos examinados. Para gerar amostras comparáveis, eles cultivaram as diferentes variedades em 2015, 2016 e 2017 nas mesmas condições geográficas e climáticas.
As análises feitas pela equipe de cientistas mostram que, em geral, as variedades modernas de trigo contêm um pouco menos proteína do que as antigas. Em contraste, o conteúdo de glúten permaneceu constante nos últimos 120 anos, embora a composição desse glúten tenha mudado ligeiramente. Enquanto a proporção de gliadinas vistas de forma crítica caiu cerca de 18%, a proporção de gluteninas aumentou cerca de 25%. Além disso, os pesquisadores observaram que uma maior precipitação no ano da colheita foi acompanhada por um maior teor de glúten nas amostras.
Condições ambientais são mais relevantes que variedade
“Surpreendentemente, as condições ambientais, como a precipitação, tiveram uma influência ainda maior na composição da proteína do que as mudanças causadas pela reprodução. Além disso, pelo menos no nível da proteína, não encontramos nenhuma evidência de que o potencial imunorreativo do trigo tenha mudado como resultado dos fatores de cultivo”, explica Katharina Scherf, que agora continua suas pesquisas como professora no Instituto de Tecnologia de Karlsruhe (KIT). No entanto, Scherf também destaca que nem todos os tipos de proteínas contidas no trigo foram investigados no que diz respeito aos seus efeitos fisiológicos. Portanto, ainda são necessárias novas pesquisas.
Fonte
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